podem ser tomadas algumas medidas básicas para agilizar o processo global TOPO clonagem e ajudar a garantir o seu sucesso. Em primeiro lugar , os tubos de células viáveis devem ser colocadas em gelo para manter a sua aceitabilidade. Em seguida , a cultura de super óptima ( SOC ) médio , o crescimento bacteriano enriquecida com nutrientes , deve ser levada até à temperatura ambiente. As placas seletivas então deve ser pré- aquecido a 37 graus Celsius para que eles sejam totalmente pronto quando chega a hora de usá-los .
Combinando ingredientes
Para começar a clonagem processo , uma combinação de 2 microlitros de polimerase de reacção em cadeia ( PCR ) do produto , 0,5 microlitros de uma solução de sal e 0,5 microlitros de vector de clonagem devem ser combinados num tubo de centrífuga de 0,5 ml. Uma vez combinados , estes ingredientes têm de ser ajustado para a temperatura ambiente e deixada a incubar durante cinco a dez minutos . Em seguida , os ingredientes combinados será adicionado ao "Top - 10 As células quimicamente competentes " em um tubo de 50 microlitros e colocada em gelo durante mais dez minutos. Após isto, as células devem ser sujeitas a choque térmico a 42 graus Celsius e exactamente colocados em gelo durante uma hora adicional antes de 180 microlitros do meio SOC é adicionado . Esta mistura deve ser abalada no sentido horizontal a 200 rpm por uma hora a 37 graus Celsius.
Etapas finais
A mistura de 50 microlitros e 100 microlitros de cada reacção deve ser plaqueadas " em placas de LB + AMP + X - Gal e incubar sem agitação durante a noite a 37 C. " No dia seguinte, as três colónias brancas a partir de cada reacção deverá ser retirado para fora e colocadas em 4 ml de LB + ampicilina e deixou -se incubar durante a noite a uma temperatura de 37 graus Celsius, enquanto está a ser agitada a 200 rpm . O passo final é a mini- preparação dos plasmídeos e esperando para ver se o processo foi bem sucedido.