A Harmonix introduziu vários novos elementos de jogabilidade em Rock Band baseados em seus esforços anteriores com a série Guitar Hero. A mudança mais óbvia foi a inclusão de canto, bateria e baixo. Qualquer instrumento pode ser jogado solo ou em grupo. Existem vários modos, mas todos apresentam a mesma jogabilidade básica.
Um dos maiores problemas de muitos jogadores com guitarra ou baixo em dificuldades altas é usar todos os cinco botões de traste. Muitos tentam relegar os trastes azul e laranja ao dedo mindinho. Isso pode funcionar, mas é ineficiente. Poucas músicas têm notas que usam os dois botões das pontas (verde e laranja) juntos. A forma mais fácil de lidar com os cinco trastes é mudar a posição da mão. Se notas verdes vêm, mantenha o indicador no verde. Se notas laranjas aparecem, mova a mão para o indicador no vermelho. Seu mindinho naturalmente ficará no laranja, enquanto o anelar cobre o azul. Em alguns casos, precisa esticar a mão para cobrir verde e laranja, mas só faça quando absolutamente necessário.
As partes de canto de Rock Band tendem a confundir. Quem não tem experiência musical foca na letra. Porém, Rock Band não analisa se você está cantando a letra correta — foca na habilidade real de canto: altura (pitch) e ritmo. Não se prenda à letra. Errar a palavra não causa penalidade. Você é penalizado por não fazer a altura certa no momento certo. Se disser a palavra errada com a altura certa no tempo certo, o jogo interpreta como correto.
A maioria dos jogadores coloca o pé todo no pedal e usa como pedal de carro. Bateristas profissionais chamam isso de método "calcanhar baixo", que tem méritos. Porém, não se traduz bem para Rock Band. Inicialmente mais fácil, mas é lento e cansa rápido. O método "calcanhar levantado" funciona melhor. Coloque os dedos na ponta do pedal, deixe o calcanhar no ar. Pode parecer estranho no início, mas com prática vira natural. Usar "calcanhar levantado" é mais rápido, vital em dificuldades altas, e usa menos músculos, permitindo tocar mais tempo sem cansar.
O Setlist Infinito contém todas as 58 músicas em uma lista. Serve como desafio final do modo "World Tour". Pode ser vencido, mas dura mais de quatro horas e meia. Mesmo no médio, a maioria luta para completar, pois é principalmente desafio de resistência. A forma mais eficaz é dividir em partes gerenciáveis. Pause quando começar a cansar, descanse e volte depois. Isso torna o Setlist Infinito muito mais fácil.