Como usar níveis de GSH na detecção de ROS

glutationa , ou GSH é um tripeptídeo não essencial feita a partir de cisteína, glutamato e glicina. Ele é um poderoso antioxidante que protege as células e órgãos do corpo contra os efeitos nocivos da ROS , ou de espécies reactivas de oxigénio , que são formadas a partir de oxigénio molecular , como resultado de vários processos metabólicos no corpo . Os antioxidantes, como a glutationa , neutralizar a ROS e impedi-los de interactuar com e danificar o DNA e de proteína nas células . A relação da forma oxidada e reduzida de GSH em seu corpo é um indicativo do estresse oxidativo relacionado com o ROS em suas body.Things você precisa
Seringa
agulha borboleta
Centrífuga
heparina de sódio
Freezer
ácido Sulfosalicylic
Agente Reação GSH
microplacas
fonte de luz
solução padrão de GSH
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1

Desenhe aproximadamente 2 ml de sangue por punção venosa para a veia anticubetal com uma borboleta agulha de calibre 23 ligada a uma seringa de 5 ml . Adicionar a amostra para tubos de ensaio contendo heparina de sódio e inverter o tubo suavemente para misturar .
2

Recolher as células vermelhas do sangue por centrifugação da amostra a 2500 rotações por minuto durante cinco minutos . Congelamento e descongelamento por três vezes para quebrar as células . Centrifuga-se o ligado celular solução durante 10 minutos a 12.000 rpm e 4 graus , e recolher o sobrenadante .
3

remover a proteína a partir da amostra por adição de 5 por cento de ácido sulfossalicílico e centrifugando a amostra a 12.000 rpm durante cinco minutos a 4 graus . Armazenar o sobrenadante desproteinadas em -112 graus .
4

Misturar um agente de detecção de tiol , GSH redutase , fosfato de dinucleótido de nicotinamida-adenina e tampão de ensaio em proporções indicadas pelo fabricante do kit para tornar a mistura de reacção de GSH . A quantidade de cada produto químico depende do número de testes que você pretende executar. Dilui-se a mistura de reacção de GSH em 5 por cento de ácido sulfossalicílico para obter concentrações de 16 , 32 , 63 , 125 , 250 e 500 microlitros .
5

Adicionar 1 a 10 microlitros da amostra de sangue deproteinado nas cavidades de uma microplaca . Adicionar solução diluída em série padrão de GSH , que está disponível no kit de teste , para cada cavidade para levar o volume total de cada poço a 10 microlitros .
6

Adicionar 90 microlitros de mistura da reacção de GSH que efectuou no Passo 4 para cada cavidade na microplaca . Misture o reagente , agitando a placa durante 30 segundos.
7

Medir a absorvância imediatamente através da colocação da placa sob luz com comprimentos de onda de 405 e 415 nanómetros . Incubar a placa durante 30 minutos. Tome leituras de absorbância após cada cinco minutos durante a incubação.
8

Diluir 6 milimolar da amostra processada com 5 por cento de ácido sulfosalicílico e solução trifluromethane sulfonato . Isto irá remover todo o GSH reduzida a partir da solução . Adicionar 1 a 10 micoliters desta solução aos poços de microplaca e repita os passos 5, 6 e 7. Isso vai ajudar estimar a quantidade de GSH oxidado na amostra.
9

Traçar a absorbância ea amostra as concentrações de um gráfico para obter a curva de GSH para ambos glutationa reduzida e oxidada . Calcula-se a relação entre as duas formas de GSH . Aumento dos níveis oxidativo níveis de GSH indicam estresse oxidativo e ROS .