Encha o tanque de imersão para o nível recomendado de água, que varia de acordo com as especificações de cada fabricante , e ligá-lo. Defina o banho de água a 65 graus Celsius e permitir que ele para chegar à temperatura. Colocar o recipiente de isopropanol em gelo . Defina a centrifugar a 3000 rotações por minuto a uma temperatura de 20 graus Celsius.
2
Pesar 2 g das folhas em um equilíbrio e colocá-los em um almofariz . Adicionar suficiente beta - mercaptoetanol através de uma pipeta para um recipiente de tampão de extracção de modo que o produto final é constituído por um a dois por cento de beta - mercaptoetanol . Por exemplo, se você tiver um volume de tampão , que mede cerca de 100 ml , adicionar 2 ml beta -mercaptoetanol ao recipiente e misture bem .
3
Pipeta tampão de extração 7 ml na argamassa . Esmague a mistura em um líquido homogêneo com o pilão.
4
Dobre um pedaço de gaze durante a formar quatro camadas . Coe e esprema o líquido através das camadas em um tubo de centrífuga de 15 ml .
5
Colocar o tubo em banho-maria por 60 min 30to utes . Agitar o tubo para misturar seu conteúdo a cada quarto de hora. Permitir que o tubo se arrefecer até à temperatura ambiente, após o período de tempo total é acima .
6
Encher o tubo com o clorofórmio e álcool isoamílico mistura ( este contém 24 partes de clorofórmio para uma parte álcool isoamílico ) , de modo que o tubo contém aproximadamente metade da amostra e meio a nova adição de líquido . Tampe o tubo e vire de cabeça para baixo algumas vezes devagar, para as misturas de fluidos.
7
Coloque o tubo na centrífuga e deixá-lo girar por 10 minutos.
8
Local 50 ml de ARNase A para um novo tubo de centrífuga . Pipeta -se o sobrenadante ( a camada transparente no topo do tubo de cima uma camada branca de detritos ) no primeiro tubo de fora e movê-lo para o segundo tubo . Tampe o tubo e inverta -o algumas vezes para misturar o conteúdo juntos. Manter o tubo à temperatura ambiente por uma hora.
9
Executar as etapas 6 e 7 de novo duas vezes para que você tenha um tubo de amostra clara. Em seguida, pipeta -se para 9 ml de um líquido claro a partir do tubo final, para um novo tubo . Adiciona-se 6 ml de isopropanol e inverter os tubos 10 vezes de um modo suave de modo que o ADN cai para fora da solução e para dentro de uma forma sólida . Em seguida centrifugar o tubo durante 10 minutos, o que deve criar uma pelete de ADN no fundo do tubo .
10
Decantar o líquido no tubo de modo que o sedimento permanece . Pipeta de etanol e 2 ml de lugar de 70% de volta na centrífuga durante cinco minutos . Deitar fora a parte líquida novamente. Use uma ponta de pipeta estéril para pegar a pelota e movê-lo para um tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril. Pipeta em 200 microlitros de água desionizada esterilizada e permitir que o ADN se dissolver completamente no líquido , o que pode levar a noite. A amostra está pronta para análise.