Como usar Sanger Reagentes

reagente de Sanger é usado para ajudar a determinar a seqüência de aminoácidos que compõem um peptídeo . O reagente irá trancar - ou tag - o aminoácido na extremidade final de uma cadeia peptídica , também conhecido como o N - terminal . O péptido pode ser então quebrado em pedaços ( hidrolisada ), e os aminoácidos individuais examinadas usando vários métodos de cromatografia . Seja qual for o aminoácido leva a etiqueta é aquele no final . Reagente de Sanger , também é conhecido como dinitrof luorobenzeno ( DNFB ) . Uma vez fechada para um aminoácido, que é referido como um DNP- compound.Things Você vai precisar de
escala de laboratório
Luvas
óculos de segurança
centrífuga
Tubos de centrífuga
pipetas Pasteur
Água destilada
solução 4,2% de bicarbonato de sódio
Reagente ( FDNB )
papel de pH de Sanger
éter etílico
solução 6M de ácido clorídrico
Acetona
Teste tubo de
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1

Pesar 3 miligramas de peptídeo em uma escala. Coloque-o em um tubo de centrífuga . Adicionar aproximadamente 0,3 ml de água , 0,3 ml de reagente de Sanger, e 0,075 ml de bicarbonato de sódio .
2

Permitir que o tubo de centrifugação se incubar à temperatura ambiente durante uma hora . Durante a incubação , agitar suavemente o tubo para evitar que a mistura se separe . Verificar o pH da solução a cada 15 minutos com papel de pH . O pH deve ser mantido acima de 9 e se começa a cair, adicionar uma pequena quantidade de bicarbonato de sódio ( cerca de uma gota com a pipeta de Pasteur ) .
3

Após a incubação , adicionar 1,5 ml de água e uma quantidade igual de éter . Permitir que a solução para separar em camadas . Você pode ter que centrifugar a mistura para separá-lo . Retirar a camada de éter ( no topo, camada amarela ) com uma pipeta e descartá-lo .
4

Ajustar o pH para 1,0 adicionando lentamente ácido clorídrico. Adicione um pouco de ácido de uma vez, mexa delicadamente , em seguida, verificar o pH com papel de pH . Ao todo , ele deve exigir cerca de 0,15 ml de ácido . Se o pH se encontre abaixo de 1,0 , adicionar uma pequena quantidade ( não mais do que uma gota ) de bicarbonato de sódio .
5

Adicionar 3 ml de éter . Permitir que a mistura a separar . Agora, a camada de topo ( a amarelo , a camada de éter ) contém o DNP - composto . Com uma pipeta, cuidadosamente extrair essa camada e transferir para um tubo de ensaio limpo. Coloque o tubo de ensaio para o lado e deixe o líquido evaporar , deixando para trás um , amarelo sólido
6

seco. Lavar o sólido com acetona. Adicionar 0,3 mililitros de acetona , agita-se suavemente e extrair o líquido com uma pipeta . Adicionar 0,75 mililitros de ácido para o tubo de ensaio . O peptídeo é agora etiquetado e pronto para ser hidrolisado e analisados ​​com o método de cromatografia de sua escolha .