Meça 200 mg de BSA na pesagem de papel usando uma escala de laboratório. Coloque -o em um tubo de microcentrífuga . Adicionar 2 ml de tampão ao tubo de microcentrífuga contendo os 200 mg de BSA . Marque esse tubo "1"
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Vortex Tubo 1 até a BSA esteja completamente dissolvido
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. Remover 500 ul da BSA em tampão e transferência lo para um segundo tubo . Marque esse tubo "2" Adicionar 500 ul de tampão simples para tubo 2
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Remover 200 ul de BSA em tampão de tubo 1 e transferi-lo para um novo tubo . Marque esse tubo "3" Adicionar 800 ul de tampão simples para tubo 3
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Remover 100 ul de BSA em tampão de tubo 1 e transferi-lo para um novo tubo . Marque esse tubo "4" Adicionar 900 ul de tampão simples para tubo 4
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Remover 10 ul de BSA em tampão de tubo 1 e transferi-lo para um novo tubo . Marque esse tubo "5" Adicionar 990 ul de tampão simples para Tubo 5. Tubes 1 a 5 compreendem uma série padrão de classificação. O primeiro tubo tem uma concentração conhecida de 100 mg /ml ; o segundo , de 50 mg /ml ; o terceiro , 20 mg /ml , a quarta , 10 mg /ml ; e quinto , 1 mg /ml . Cada tubo contém aproximadamente 1 ml de solução.
Criar Antibody diluições
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Adicionar 5 0ul de anticorpo purificado a 95 0ul de tampão . Marque esse tubo " A. "
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Adicionar 10 ul de anticorpo purificado a 990 ul de tampão . Marque esse tubo "B"
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Adicionar 2 ul de anticorpo purificado a 998 ul de tampão . Marque esse " C. " tubo
Carregue a placa
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Coloque 0,5 ml de tampão liso nos primeiros poços em duas colunas da placa com múltiplas cavidades .
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Colocar 0,5 ml do conteúdo de um tubo nos segundos poços das duas primeiras colunas da placa com múltiplas cavidades . Continue o série gradual até que as duas primeiras colunas contêm 0,5 ml de uma solução padrão de BSA a partir de cada um dos tubos 1-5 , incluindo os poços de tampão puro .
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Adicionar 0,5 ml de reagente de Bradford a cada bem . Agitar a placa para misturar o reagente com as soluções proteicas , tomando cuidado para não derramar o conteúdo de qualquer um dos poços. Espere 5 minutos .
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Leia a placa de acordo com o protocolo específico para o seu leitor de placas a um comprimento de onda de 595 nm .
Calcular Antibody Concentração
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Copie os valores lidos do leitor de placas para o Microsoft Excel.
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Criar um gráfico a partir de duas colunas de valores que representam o padrão BSA usando o Assistente de gráfico do Microsoft Excel.
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Marque os pontos medidos a partir das diluições de anticorpos no gráfico do Excel. Leia a concentração correspondente de proteína de acordo com o valor do eixo y para o ponto de diluição do anticorpo no gráfico do Excel.
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Dependendo se você estiver usando os valores obtidos a partir de tubo A, B ou C, multiplicar o valor por qualquer 20, 40 ou 500, respectivamente. O valor resultante é a concentração de seu anticorpo purificado .