O jogo "Spider-Man 3" baseia-se no terceiro filme. Peter Parker descobre um traje alienígena que aumenta sua força, mas muda sua atitude. Enfrenta vilões como Homem-Areia, Novo Duende e Venom. Apesar do título, há outros personagens jogáveis:
Disponível desde o início. Balança com teias, prende inimigos, força proporcional de aranha, gruda em paredes. Possui ataques especiais usando velocidade, força e teias. O "sentido de aranha" avisa de ataques e guia pelo mapa.
Aumenta a força. Ao ser atacado, enche medidor de fúria que libera ataques especiais (ex.: teia como martelo). Disponível apenas em certos momentos na primeira jogada. Derrote Venom na fase final para desbloquear o traje preto em todas as fases do modo história.
Harry Osborn vira Novo Duende. Requer Edição de Colecionador ou DLC na Xbox Live. Desbloqueado como jogável apenas após ser derrotado no modo história. Move-set totalmente diferente: usa "Goblin Glider" (planador) e lança bombas de abóbora.
Alter ego do Homem-Aranha. Tem as mesmas habilidades do traje vermelho, mas não pode usá-las todas sem revelar sua identidade. Disponível em áreas como o escritório do Clarim Diário ou no tutorial com Mary Jane. Limitado a balanço de teia e socos; serve basicamente para locomoção.